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1 主题内容和适用范围
本程序和检验方法规定了评价食品保健作用的统一程序和检验方法。
本程序和检验方法适用于评价食品的免疫调节、延缓衰老、改善记忆、促进生长发育、抗疲劳、减肥、耐缺氧、抗辐射、抗突变、调节血脂、改善性功能等作用。
本程序和检验方法规定了评价食品保健作用的人体试食试验规程。
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2 进行食品保健作用评价的基本要求
2.1 对受试物的要求
2.1.1 提供受试物的物理、化学性质(包括化学结构、纯度、稳定性等)等有关资料。
2.1.2 受试物必须是规格化的产品，即符合既定的生产工艺、配方及质量标准。
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2.1.3 提供受试物安全性毒理学评价的资料，受试物必须是已经过食品安全性毒理学评价确认为安全的物质。
2.2 对实验动物的要求
2.2.1 根据各种试验的具体要求，合理选择实验动物。常用大鼠和小鼠，品系不限，推荐使用近交系动物。
2.2.2 动物的性别不限，可根据试验 要进行选择。动物的数量的要求为小鼠每组至少10只（单一性别），大鼠每组至少8只(单一性别)。动物的年龄可根据具体试验 要而定。
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2.2.3 动物应达到二级实验动物的要求。
2.3 给受试物的剂量及时间
2.3.1 各种试验至少应设3个剂量组，1个对照组，必要时可设阳性对照组。剂量选择应合理，尽可能找出最低有效剂量。在3个剂量组中，其中一个剂量应相当于人推荐摄入量的5－10倍左右。
2.3.2 给受试物的时间应根据具体试验而定，原则上至少1个月。
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3 试验项目、试验原则及结果判定
3.1 免疫调节作用
3.1.1 试验项目
3.1.1.1.1 脏器/体重 比值 胸腺/体重 比值 脾脏/体重 比值
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3.1.1.1.2 细胞免疫功能测定 小鼠脾淋巴细胞转化实验 迟发型变态反应
3.1.1.1.3 体液免疫功能测定 抗体生成细胞检测 血清溶血素测定
3.1.1.1.4 单核－巨噬细胞功能测定 小鼠碳廓清试验
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验
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3.1.1.1.5 nk细胞活性测定
3.1.1.2 人体试食试验
3.1.1.2.1 细胞免疫功能测定 外周血淋巴细胞转化试验
3.1.1.2.2 体液免疫功能试验 单向免疫扩散法测定igg、iga、igm
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3.1.1.2.3 非特异性免疫功能测定 吞噬与杀菌试验
3.1.1.2.4 nk细胞活性测定
3.1.2 试验原则
要求选择一组能够全面反映免疫系统各方面功能的试验，其中细胞免疫、体液免疫入单核－巨噬细胞功能三个方面至少各选择1种试验，在确保安全的前提下尽可能进行人体试食试验。
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3.1.3 结果判定
在一组试验中，受试物对免疫系统某方面的试验具有增强作用而对其他试验无抑制作用，可以判定该受试物具有该方面的免疫调节效应；对任何一项免疫试验具有抑制作用可判定该受试物具有免疫抑制效应。
在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核－巨噬细胞功能及nk细胞功能检测中，如有两个以上(含两个)功能检测结果阳性，即可判定该受试物具有免疫调节作用。
3.2 延缓衰老作用
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3.2.1 试验项目
3.2.1.1 动物试验
3.2.1.1.1 生存试验
小鼠生存试验
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大鼠生存试验
果蝇生存试验
3.2.1.1.2 过氧化脂质含量测定
血(或组织)中过氧化脂质降解产物丙二醛(mda)含量测定
组织中脂褐质含量测定
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3.2.1.1.3 抗氧化 活力测定
血(或组织)中超氧化物歧化 (sod)活力测定
血(或组织)中谷胱甘 过氧化物 (gsh-px)活力测定
3.2.1.2 人体试食试验
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血中过氧化脂质降解产物丙二醛(mda)含量测定
血中超氧化物歧化 (sod)活力测定
血中谷胱甘 过氧化物 (gsh－px)活力测定
3.2.2 试验原则
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衰老机制比较复杂，迄今尚无一种公认的衰老机制学说，因而无单一、简便、实用的衰老指标可供应用，应采用尽可能多的试验方法，以保证试验结果的可信性。动物试验，除上述生存试验，过氧化脂质含量测定、抗氧化 活力测定3个方面各选一项必做外，可能时应多选择一些指标(如脑、肝组织中单胺氧化 (mao-b)活力测定等)加以辅助。生存试验是最直观、最可靠的实验方法，果蝇具有自下而上期短，繁殖快，饲养简便等优点，通常多选果蝇作生存试验，但果蝇种系分类地位与人较远，故必须辅助过氧化脂质含量测定及抗氧化 活力测定才能判断是否具有延缓衰老作用。生化指标测定应选用老龄鼠，除设老龄对照外，最好同时增设少龄对照，以比较受试物抗氧化的程度，必要时可将动物试验与人体试食试验相结合综合评价。
3.2.3 结果判定
若大鼠或小鼠生存试验为阳性，即可判定该受试物具有延缓衰老的作用。
若果蝇生存试验，过氧化脂质和抗氧化 三项指标均为阳性，即可判定该受试物具有延缓衰老的作用。
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若过氧化脂质和抗氧化 两项为阳性，可判定该受试物具有抗氧化作用，并提示可能具有延缓衰老作用。
3.3 改善记忆作用
3.3.1 动物试验
跳台试验
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避暗试验
穿梭箱试验
水迷宫试验
3.3.1.2 人体试食试验
韦氏记忆量表
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临订记忆量表
3.3.2 试验原则
3.3.2.1 试验应通过训练前、训练后及重测验前3种不同的给予受试物方法观察其对记忆全过程(记忆的获得、记忆巩固、记忆再现)的影响。
3.3.2.2 应采用一组(2个以上)行为学试验方法，以保证实验结果的可靠性。
3.3.2.3 人体试食试验为必做项目，并应在动物试验有效的前提下进行。
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3.3.2.4 除上述试验项目外，还可以选用嗅觉厌恶试验、味觉厌恶试验、操作式条件反射试验，连续强化程序试验、比率程序试验、间隔程序试验。
3.3.3 结果判定
动物试验2项或2项以上的指标为阳性，且2次或2次以上的重复测试结果一致，可以认为该受试物具有改善该类动物记忆作用；
若人体试食试验结果阳性，则可认为该受试物具有改善人体记忆作用。
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3.4 促进生长发育作用
3.4.1 试验项目
3.4.1.1 胎仔情况 活胎数、雄比例、死胎数、分娩胎仔总数。
3.4.1.2 体重及食物利用率 记录出生时及生后4、7、14、21、30、60d幼鼠的体重，计算断乳后幼鼠的
食物利用率。
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3.4.1.3 生理发育指标 记录耳廓分离、门齿萌出、开眼、长毛时间、阴道开放、睾丸下降时间。
3.4.1.4 神经反射指标 平面翻正、前肢抓力、悬崖回避、嗅觉定位、听觉警戒、负趋地性、回旋运动、视觉发育、空中翻正、游泳发育。
3.4.2 试验原则
3.4.2.1 给受试物的时间可根据具体情况选择在母鼠孕期或哺乳期至成年期。
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3.4.2.2 在神经反射指标中应选择一组(5个以上)的行为学试验方法，以保证结果的可靠性。
3.4.3 结果判定
在胎仔情况、体重及
食物利用率、生理发育、神经反射4类指标中有3类以上(含3类)指标为阳性，可认为受试物有促进生长发育的作用。
3.5 抗疲劳作用
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3.5.1 试验项目
负重游泳试验
爬杆试验
血乳
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血清尿素氮
肝/肌糖原测定
3.5.2 试验原则
运动试验与生化指标检测相结合。在进行游泳或爬杆试验前，动物应进行初筛。除以上生化指标外，还可检测血糖、乳胶氢 、血红蛋白以及磷肌等指标。
3.5.3 结果判定
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若1项以上(含1项)运动试验和2项以上(含2项)生化指标为阳性，即可以判断该受试物具有抗疲劳作用。
3.6 减肥作用
3.6.1 减肥原则
3.6.1.1 减除体现人多余的脂肪，不单纯以减轻体重为标准。
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3.6.1.2 每日
营养素的摄入量应基本保证机体正常生命活动的要求。
3.6.1.3 对机体健康无明显损害。
3.6.2 试验项目
3.6.2.1 动物试验
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体重
体内脂肪重量(睾丸及肾周围脂肪垫)
3.6.2.2 人体试食试验
体重，体重指数，腰围，腹围，臀围
体内脂肪含量
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3.6.3 试验原则
在进行减肥试验时，除以上指标必测外，还应进行机体营养状况检测，运动耐力测试以及与健康有关的其它指标的观察。人体试食试验为必做项目，动物试验与人体试食试验相结合，综合进行评价。
3.6.4 结果判定
在动物试验中，体重及体内脂肪垫2个指标均阳性，并且对机体健康无明显损害，即可初步判定该受试物具有减肥作用。
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在人体试食试验中，体内脂肪量显著减少，且对机体健康无明显损害，可判定该受试物具有减肥作用。
3.7 耐缺氧作用
3.7.1 试验项目
小鼠常压耐缺氧实验
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3.7.2 结果判定
耐缺氧实验阳性，说明该受试物具有耐缺氧作用。
3.8 抗辐射作用
3.8.1 试验项目
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3.8.1.1 亚急性试验
30天存活率或平均存活时间
白细胞总数
3.8.1.2 亚慢性或慢性试验
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小鼠睾丸染色体畸变试验
小鼠骨髓细胞微核试验
3.8.2 试验原则
较高剂量一次辐射，选择亚急性试验；小剂量多次辐射，选择亚慢性或慢性试验。
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3.8.3 结果判定
亚急性试验项目中2项结果为阳性，则可判定该受试物对较高剂量一次辐射有拮抗作用。
亚慢性或慢性试验中2项结果为阳性，则可判定该受试物对小剂量多次辐射有拮抗作用。
3.9 抗突变作用
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3.9.1 试验项目
ames试验或v79细胞基因突变试验
小鼠骨髓细胞微核试验
小鼠睾丸染色体畸变试验
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3.9.2 试验原则
ames试验与v79细胞基因突变试验任选一项，采用体内与体外试验相结合的原则。
3.9.3 结果判定
抗突变三项试验中有两项为阳性时，则可判定该受试物具有抗突变作用。
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3.10 抑制肿瘤作用
3.10.1 试验项目
动物诱发性肿瘤试验
动物移植性肿瘤试验
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免疫功能试验
nk细胞活性测定
单核－巨噬细胞功能测定
3.10.2 试验原则
动物诱发性肿瘤试验及动物移植性肿瘤试验两项中任选一项，同时必做2项免疫功能试验
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3.10.3 结果判定
动物诱发性肿瘤试验及动物移植性肿瘤试验两项试验中有一项为阳性，并且对免疫功能无抑作用，则可判定该受试物具有抑制肿瘤的作用。
3.11 调节血脂作用
3.11.1 试验项目
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大鼠脂代谢紊乱模型法
人体试食试验
3.11.2 试验原则
尽可能动物试验和人体试食试验相结合，综合进行评价。
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3.11.3 结果判定
大鼠脂代谢紊乱模型法：结果为阳性时，可初步判定该受试物具有调节血脂作用。
人体试食试验阳性，可判定该受试物对人体具有调节血脂作用。
3.12 改善性功能作用
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3.12.1 试验项目
3.12.1.1 交配试验
大鼠交配试验
小鼠交配试验
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3.12.1.2 勃起试验
3.12.2 试验原则
评价改善性功能作用，应主要观察是否增强性交功能及阴茎勃起功能。考虑到影响性功能的因素很多，而睾酮对性功能的维持具有重要意义，必要时可对血清睾酮水平进行测定。
3.12.3 结果判定
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交配试验(大、小鼠交配试验任选一项)或勃起试验中有一项试验结果为阳性，即可判定该受试物具有改
善性功能的作用。
3.13 人体试食试验规程
4 评价食品保健作用时 要考虑的因素
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4.1 人的可能摄入量 除一般人群的摄入量外，还应考虑特殊的和敏感的人群(如儿童、孕妇及高摄入量
人群)。
4.2 人体资料 由于存在著动物与人之间的种属差异、在将动物试验结果外推到人时，应尽可能收集人群服用受试物的效应资料，若体外或体内动物试验未观察到或不易观察到食品的保健效应或观察到不同效应，而有关资料提示对人有保健作用时，在保证安全的前提下，应进行必要的人体试食试验。
4.3 在将本程序所列试验的阳性结果用于评价食品的保健作用时，应考虑结果的重复性和剂量反应关系，并由此找出其最小有作用剂量。
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4.4 食品保健作用的检测及评价应由卫生部认定的保健食品功能学检验机构承担。
附加说明
本程序和检验方法由卫生部卫生监督司提出。
本程序和检验方法由卫生部食品卫生监督检验所《保健食品功能学评价程序和检验方法》起草小组负责起草。
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本程序和检验方法由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。
进行未列入程序范围的保健食品功能学评价时，应由保健食品的研制生产者提出检验及评价方法，经保
健食品功能学检验机构验证及卫生部食品卫生监督检验所组织专家评审，报卫生部批准后方可列入本程序。
本程序中无明确判定方法的人体试食试验结果，可由负责试验单位组织专家组(至少五人)，按本程序提出的原则要求共同予以评价，并提出判定结果。
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免疫调节作用检验方法
动物试验
1 实验动物
选用小鼠。推荐使用近近交系小鼠，如c57bl/6j、balb/c等，6－8周龄，18－22g，雄均可，数量为单一性别每组至少10只。
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2 给受试物的时间、剂量分组
经口给予受试物15－30d，设3个剂量组和1个对照组。3个剂量组中，其中1个剂量应相当于人推荐摄入量的10倍左右。
3 实验方法
3.1 cona诱导的小鼠脾淋巴细胞转化试验
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可任选下列方法之一
3.1.1 mtt法
3.1.1.1 原理
当t淋巴细胞受cona、pha等致分裂原或特异性抗原刺激后发生母细胞转化，活细胞特别是增殖细胞通过线粒体水解 将mtt(一种淡黄色的唑氮盐)分解为兰紫色的甲(formazan)结晶而显色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。
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3.1.1.2 丁器和材料
rpmi1640细胞培养液、小牛血清、2－ 基乙醇(2－me)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白a(cona)、盐、异丙醇、mtt、hanks液、pbs缓冲液(ph7.2-7.4)
200目筛网、24孔培养板，96孔培养板(平底)，手术器械、二氧化碳培养箱、 联免疫检测丁、超净工作台
3.1.1.3 实验步骤
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完全培养液 rpmi1640 培养液过滤除菌，用前加入10％小牛血清，1％谷氨 胺(200mmol/l)，青霉素(100u/ml)，链霉素(100ug/l)及5×10－5mol/l的2－ 基乙醇，用无菌的1mol/l的hcl或1mol/l的naoh调ph至7.0－7.2，即完全培养液。
cona液 用双蒸水配制成100ug/ml的溶液，过滤除菌，在低温冰箱(－20℃)保存。
无菌hanks液 用前以3.5％的无菌nahco3调ph7.2－7.4。
mtt液 将5mgmtt溶于1ml ph7.2的pbs中，现配现用。
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性异丙醇溶液 96ml 异丙醇中加入4ml 1mo1/l的hc1，临用前配制。
3.1.1.3.2 脾细胞悬液制备
无菌取脾，置于盛有适量无菌hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，用hanks液洗3次，每次离心10min (1000r/min)。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，调整细胞浓度为2×106个/ml。
3.1.1.3.3淋巴细胞增殖反应
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将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1ml，一孔加50ul cona液(相当5ug/ml)，另一孔作为对照，置5％co2，37℃培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7ml不含小牛血清的rpmi1640培养液，同时加入mtt(5mg/ml)50u1/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1ml性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3￣6孔作为平行样，用 联免疫检测丁，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入1ml比色杯中，在721分光光度计上比色测定，波长570nm。
3.1.1.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。用加cona孔的光密度值减去不加cona孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试物组的光密度值显著高于对照组的光密度值，即可判定该项试验结果阳性。
3.1.2 同位素掺入法
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3.1.2.1 原理
淋巴细胞在有丝分裂原pha、cona等的刺激下，产生增殖反应，dna和rna合成明显增加，如在培养液中加入3h－胸腺嘧啶核 (3h－tdr)，则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞和放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。
3.1.2.2 丁器和材料
rpmi－1640细胞培养液、小牛血清、2－ 基乙醇(2－me)、青霉素、链霉素、刀豆蛋白a (cona)、hanks液 、pbs缓冲液(ph7.2－7.4)、3h－tdr、闪烁液[2.5－二苯基 恶唑(ppo) 0.5g、1，4－双－(5－苯基 恶唑基)－苯(popop)0.25g、二甲苯500ml混匀
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200目筛网，96孔培养板(平底)，手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁丁、多头细胞取集器、49型玻璃纤维滤纸。
3.1.2.3 实验步骤
3.1.2.3.1 脾细胞悬液制备
无菌取脾，置于盛有适量无菌hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用hanks液洗3次，每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数(应在95％以上)，最后rpmi1640完全培养液将细胞数调成5×105个/ml。
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3.1.2.3.2 淋巴细胞增殖反应：
将脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装6个孔，3孔加cona(5ug/ml)，另3个孔不加cona作为对照。置5％ co2，37℃培养72h，培养结束前6h，每孔加入3h－tdr 20u1，使其终浓度为(3.7－18.5)×104bq/ml。用多头细胞取集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中，加入7ml闪烁液，用液闪丁测定每分钟脉冲数(cpm)。
3.1.2.4 数据处理及结果判定
一般采用方差分析进行数据统计。以每分钟脉冲数(cpm)表示增殖程度，用刺激指数(si)来表示 试验孔cpm 。
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